人类呼吸道微生物组及检测技术进展
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人类呼吸道微生物组及检测技术进展
人类呼吸道中包含由细菌、真菌和病毒组成的微生物群落，其微生物平衡失调与各种呼吸系统疾病有关。近年随着分子生物检测技术的发展、应用，越来越多的证据显示呼吸道微生物组拥有巨大的多样性和异质性，且与人类健康息息相关，成为潜在的致病因素或治疗靶标。健康和疾病状态的肺部含有不同的微生物，然而呼吸道微生物生态系统的相互作用和呼吸道健康与疾病的转换机制尚不清楚。这也对新型检测技术的发展提出更高的要求，只有不断优化分析技术才能更全面认识呼吸道微生物组，解析致病机制和探索基于微生物组的治疗策略。
1 人类呼吸道微生物组的研究现状
在过去十年中，对人体微生物组的研究已经从肠道和其他富含微生物的环境扩展到以往认为是无菌的场所，例如膀胱和肺[1]。尽管已知肺部在急性感染和慢性化脓性疾病如支气管扩张和囊性纤维化中含有微生物，但最近才通过不依赖培养的方法描述了健康肺部的微生物群落[2]。健康的肺具有极低的微生物量，与微生物群的栖息地（如肠道、皮肤、口腔和阴道）相比，微生物群在数量和动态上具有显著差异。近年来随着微生物组检测技术的发展，越来越多的证据显示人类微生物组具有巨大的多样性和异质性，在健康和疾病状态的上呼吸道中存在某些特定的微生物群。
1.1 健康人呼吸道（口腔和上呼吸道）微生物组
上呼吸道由鼻、咽、喉组成。鼻腔是呼吸道与外界相通的开端，也是皮肤与黏膜的延续部分，因此鼻前庭的微生物群与皮肤微生物群类似，主要为葡萄球菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属等亲脂性菌群，鼻腔菌群以莫拉菌属、变形杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属及棒状杆菌属占优势。此外还包括狡诈球菌属和其他几种细菌[3]。咽部包括鼻咽、口咽和喉咽，鼻咽部与前鼻部菌群有重叠，但较前鼻部更多样，除上述菌种外，还存在大量嗜血杆菌属等[4]。口咽部菌群与鼻咽相似，但种类更多，以链球菌属、奈瑟菌属、罗斯菌属和厌氧菌，包括韦荣球菌属、普氏菌属和纤毛菌属为特征[5]。对健康人的病毒组进行分析，发现了巨细胞病毒、淋巴隐病毒、玫瑰色病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒等，包括未分类的多瘤病毒、乳腺腺病毒、依赖性病毒、α-torke-virus和未分类的anelloviruse[6]。总的来说，这些观察结果表明，真核病毒存在于口腔和呼吸道的不同部位，在鼻腔区域的丰度和多样性要高得多[7]。
1.2 急性呼吸系统疾病微生物组
急性呼吸系统疾病主要包括肺炎、脓毒症以及近年全球暴发的新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）等局部或全身性致病性感染引起的肺部急性炎症。新冠肺炎患者呼吸道标本宏基因组测序显示，8%的样本同时感染了鼻病毒和流感病毒，病毒组富集真核病毒，以及大肠埃希菌和肠杆菌噬菌体，与肠道炎症过程和宿主的干扰素反应有关，这再次凸显了全面研究急性呼吸道病毒感染（acute respiratory viral infection，ARVI）病毒成分的重要性[8]。急性肺损伤（ALI）和更严重的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是两类与肺部微生物组存在紧密联系的急性呼吸系统症状[9]。Dickson等[10]研究表明，脓毒症和ARDS患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）样本中存在肠道特异性细菌（如拟杆菌属）的富集，且其与气道肿瘤坏死因子显著关联，这一发现为危重症患者的肠道菌群易位提供了证据。该研究小组后续对91例危重患者的BALF样本进行了研究，发现一些肠道特异菌（包括毛螺菌科和肠杆菌科）的富集与临床结局较差相关。Panzer等[11]也发现，危重患者进展为ARDS这一过程与肠杆菌在肺部的富集以及和一些与吸烟相关的菌属（如普氏菌及梭杆菌）存在关联。通过采集和分析47例机械通气患者BALF样本，Kyo等[12]发现葡萄球菌、链球菌和肠杆菌科与血清中的白细胞介素-6（IL-6）以及死亡率呈正相关。同样，Kitsios等[13]发现，气管抽吸物中葡萄球菌和假单胞菌的富集与机械通气患者临床结局存在关联。这些结果都表明，ALI/ARDS患者中气道生态失调伴随肠道相关或其他病原菌的富集，并且该趋势与较差的临床结局存在关联。
1.3 慢性呼吸系统疾病微生物组
慢性呼吸系统疾病是肺部微生物组研究广泛关注的领域，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘、支气管扩张症、囊性纤维化、间质性肺纤维化等。这些疾病的一个关键表型是在整个疾病进展过程中持续伴随的慢性气道炎症。在Hilty等[14]对“肺部无菌论”提出质疑的这一标志性研究中，发现肺部菌群在COPD、哮喘和健康对照之间存在差异，疾病状态下变形菌门的丰度升高。这种差异模式得到了之后许多研究的支持，表明变形菌门（如嗜血杆菌、莫拉氏菌和假单胞菌）与疾病关键临床特征存在关联。
Depner等[15]有关儿童哮喘与微生物的研究表明，鼻腔微生物群的改变与患儿哮喘的发生相关。该研究通过利用16S rRNA测序法分析了来自农场和非农场学龄期儿童327例咽喉部和68例鼻部样本的微生物区系，结果表明，鼻微生物区系的多样性随哮喘状况而变化；相反，咽喉微生物群的多样性并不随哮喘状态而变化，与健康儿童相比，哮喘患儿鼻腔微生物群的多样性较低，莫拉菌属的多样性和数量均较健康儿童低。此外，Mendez等[16]的研究也显示哮喘患者呼吸道微生态与健康人群存在明显差异，将哮喘个体的肺微生态与健康对照进行比较，发现变形菌门的水平增加，但拟杆菌门的水平降低。
Molyneaux等[17]通过支气管镜检查收集BALF样本，利用16S rRNA测序、实时荧光定量PCR和焦磷酸测序方法，对比急性加重的特发性肺纤维化和稳定的肺纤维化患者的标本后发现，在急性加重患者中，弯曲杆菌属和嗜麦芽窄食单胞菌属增多，而稳定患者中韦荣球菌属则较多。另外，O’Dwyer等[18]利用小鼠肺纤维化模型的研究表明，肺部微生态的改变与小鼠局部宿主炎症相关，可促进特发性肺纤维化的病情进展，以上研究均表明呼吸道菌群的改变与肺纤维化的发展密切相关。
1.4 其他呼吸系统疾病相关微生物组
肺部菌群还与其他免疫类呼吸系统疾病有关，包括肺癌、肺移植术后并发症、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）和结核病等。气道微生态失衡可能参与肺癌发病过程，甚至肺部微生物组与肺癌关键突变位点和信号通路进一步关联。Greathouse等[19]的研究表明，肺部食酸菌属的增加与TP53突变有关；Tsay等[20]发现，下气道中口腔类群（如链球菌和韦永氏菌）的富集与胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信号转导有关，Tsay进一步机制研究表明，肺部生态失调与肺癌的发展以及较差的预后有关，特别是口腔来源的小韦荣球菌富集会导致肺癌小鼠模型存活率降低、肿瘤负荷增加、IL-17炎症上调以及免疫检查点抑制剂表达上调。肺部微生物组也与肺癌免疫治疗反应有关。Jang等[21]的研究表明，殊异韦荣球菌在细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）较高肺癌患者中占主导地位，而深黄奈瑟球菌在对免疫治疗无效的患者中占主导地位。
人类免疫缺陷病毒（HIV）是早期肺部微生物组研究所关注的领域之一，研究发现在HIV携带者的下气道中检测到惠普尔养障体，且其含量在经过高活性抗逆转录病毒治疗（HAART）后明显减少[22]。随后研究表明，在经历HAART 1年后，HIV携带者肺部的普氏菌和韦氏菌含量增加[23]。同时，在HIV感染的人类与灵长类动物中均检出耶氏肺孢子菌。对于结核病来说，其致病因子结核分枝杆菌（MTB）在结核病患者BALF中含量升高，尽管其在不同研究中检出率存在差异。其他与结核病呈正相关的菌还包括贪铜菌属、卟啉单胞菌以及链球菌。曲霉菌和念珠菌在结核病患者肺部也同样存在富集。
2 呼吸道微生物组检测技术
传统的呼吸道微生物检测方法包含涂片镜检、培养、抗原抗体检测等，随着分子检测技术和基于测序的方法涌现，改善了对呼吸道微生物尤其病毒和培养困难微生物的检出能力，不断丰富对呼吸道微生物生态系统的认识。
2.1 呼吸道微生物检测技术
分离培养作为呼吸道病原体检测的“金标准”，特异性高、成本低，但对于一些难以培养的病原体（如病毒、衣原体）来说，时效性和敏感性较差[24]。因此这些病原体的分离培养不适用于常规检测。涂片检测的优点是快速、直观、成本低，临床易于开展，但缺点是敏感性偏低，并且非常依赖于检验工作人员的经验。免疫学检测是通过血清学来检测抗原和（或）抗体的检测方法。在疾病早期，抗原检测的诊断价值较高，可通过直接免疫荧光法或间接免疫荧光法、免疫层析法检测病原体的抗原蛋白。免疫学检测操作简便、成本低，缺点是敏感性低、易漏检，存在窗口期（见表1）。核酸检测技术可快速精准地识别病原体并及时诊断感染性疾病。荧光定量PCR技术稳定性和重复性好，已广泛应用于流感、结核等呼吸道病原体的诊断中；宏基因组二代测序（mNGS）作为克服传统诊断方法缺点的新工具，可检测新发、少见病原微生物，同时还可有效提高难检病原、混合感染的灵敏度。除鉴定病原体外，mNGS还可提供微生物组分析、人类宿主反应分析和耐药性预测所需的额外基因组信息，这些潜在应用都更有助于人类呼吸道微生物的进一步研究[25]。
2.2 宏基因组测序技术在微生物组的应用
宏基因组测序技术的发展是研究微生物组的一个重要里程碑。mNGS的检出无偏倚性，能够在不明原因肺炎中检测出新型罕见的致病微生物。2019年底流行的新冠肺炎，2020年2月3日通过mNGS的RNA测序，一种新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）被确定[26]。与识别SARS所需的5个月时长相比，mNGS将鉴定所需时长迅速缩短至5 d。mNGS作为独立于培养的检测方法，有望在更短的时间内检出苛养病原，Shi等[27]最近的一项研究表明，mNGS对MTB的检测灵敏度为47.92%，其中赛沛（X-pert）为45.83%，培养为46.81%。除此之外，mNGS仅需3 d即可识别67.23%的MTB感染病例，而使用培养方法所需时间49.58%在90 d以上。
在健康和疾病状态下呼吸道微生物的种类和数量存在明显差异，这为许多呼吸道疾病的发病机制及诊断、治疗提供了新的研究方向。Langelier等[28]使用mNGS对92例急性呼吸衰竭患者的研究表明，下呼吸道感染（lower respiratory tract infection，LRI）与呼吸道微生物组的α和β多样性降低有关。此外，该研究使用α多样性预测LRI，并计算相应的曲线下面积（AUC）来评估预测的准确性，其中训练集的AUC是0.96 (95% CI:0.89~1.00)，验证集的AUC是0.80 (95% CI:0.63~0.96)。目前，虽然没有基于微生物组对疾病诊断的临床验证，但mNGS为气道微生物组分析提供了一种有效的手段，同时也有助于区分感染性和非感染性疾病。
RNA测序不仅可以进行分类学分析，还可以评估宿主免疫反应。mNGS RNA测序可作为临床区分感染或非感染性疾病、细菌或病毒感染的辅助工具。有研究表明使用RNA测序分析LRI患者与非LRI患者之间的基因表达差异[28]，发现前者天然免疫反应核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号转导、细胞因子产生和Ⅰ型干扰素反应相关的通路表达增加，而后者氧化应激反应与主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）类受体信号转导相关基因表达增加。此外，该团队还鉴定了病毒和细菌感染之间的4个差异表达基因（RSAD2、OAS3、CXCL2和DUSP2），提示不同类型病原体感染情况下宿主可能存在不同的反应模式。但是，当前的湿实验方法尚无法检测出存在的所有病毒，人类对病毒组组成的理解仍不完整。新一代扩增方法可以解决与大多数病毒组样本相关的低生物量问题，同时可降低全基因组扩增引起的错误率和偏差。将长读测序应用于病毒组样本可以解决短读测序在生成完整病毒基因组方面的缺点，并避免组装带来的偏差。为测量病毒宿主范围而开发的新实验方法可以帮助克服将宿主分配给许多噬菌体的困难，特别是不可培养的噬菌体。
随着测序技术的发展，依赖培养的全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和无需培养的mNGS技术皆可用于预测病原耐药性。与WGS相比，mNGS更有利于评估生长周期长、苛养病原体和因暴露抗菌药物死亡病原体的耐药状态。Wang等[29]使用MinION和BGISEQ-500平台从培养阴性的肺组织样本中进行mNGS诊断，两个平台均确定肺炎克雷伯菌为最主要的病原体，并提供了抗菌药物耐药基因的相关信息，但MinION平台检测更迅速，分别在第29、38和56 min鉴定出抗性基因blaSHV-12、aac(3)-IIa和blaKPC-2。
3 呼吸道微生物组检测技术的挑战和展望
目前，NGS技术已成功用于检测新病毒，特别是在已知和（或）新出现的疾病暴发中。NGS测序技术和生物信息学分析是在临床和公共卫生环境中快速识别病原体的有力工具。这允许对传统检测技术无法确定的新病原体进行表征，适用于在危急情况下快速检测病原体。将NGS引入诊断系统将有助于促进呼吸道感染的诊治和研究，我国专家在临床评估基础上也发布了相应的专家共识[30-31]。然而，将NGS技术用于诊断目的的有效性和可行性尚待评估完善，测序技术的优化、检测过程的标准化和生物信息学方法必须提高准确性、可重复性和技术的多功能性。
临床上，细菌、病毒和真菌的合并感染或继发感染常见，而且是进行性的。细菌组、真菌生物组和病毒组之间的复杂相互作用对呼吸道感染治疗和控制构成了巨大挑战。当前对呼吸道微生物组的理解主要基于描述性研究，几乎没有因果和（或）转化研究。人类健康和疾病背景下的微生物组基础和转化研究尚待回答和解决的关键问题有：①鉴于低微生物载量样本中普遍存在污染，从采样到数据分析是否有一套标准化的最佳实践程序?②是否存在哺乳动物特有且保守的核心肺部微生物群?③可否通过评估健康人群的微生物组如何改变肺组织的局部免疫，阐释共生微生物的有益作用机制?④哪些因素影响肺部健康和疾病中的微生物异质性?⑤微生物异质性能否指导针对肺部疾病的个性化药物形式?
未来，有望利用和整合物理学、化学、组学、血清学、材料学、反向遗传学、生物信息学、图像处理、人工智能、类器官等相关领域进展，建立可靠的微生物组核酸制备和文库构建测序技术、快速精准的基因组和转录组注释方法、高效流畅的数据分析平台、安全稳定的多组学交互模型体系，逐步阐明微生物组相互作用以及与宿主的关系，在呼吸道疾病的临床诊治和公共卫生防控中发挥决定性作用。
引用：吴文娟, 田文杰. 人类呼吸道微生物组及检测技术进展[J]. 内科理论与实践, 2024, 19(01): 37-42 doi:10.16138/j.1673-6087.2024.01.07